Western blotting广泛用于分析目标蛋白是否出现在特定组织/细胞中及其数量变化和位移。它是实验室最常用的蛋白质分析平台。但由于技术环节较多，获得稳定、一致、高质量的结果并不容易。接下来我们来分析一下WB实验中常见的令人头疼的问题：

蛋白质印迹原理

测定蛋白质浓度的常用方法：

BCA 方法：

在碱性环境中，蛋白质由二价铜离子合成，二价铜离子被还原为一价铜离子。该配合物在562nm处具有较高的吸收值，BCA法与SDS、TritonX-100和Tween的兼容性高达5%。如果溶液中含有与铜离子发生反应的螯合剂（如EDTA）或还原剂（如DTT、-巯基乙醇），结果将受到很大影响。

布拉德福德方法：

带负电荷的考马斯亮蓝燃料与蛋白质碱性氨基酸相互作用，在595 纳米处有吸收峰。高洗涤剂浓度对Bradford 法最大相容浓度的影响为0.125%。 Tween-20（80），最大配伍浓度0.061%；咪唑（PH7.0），最大配伍浓度200mM，与还原剂配伍。

A280方法：操作简单。蛋白质中具有共轭双键的酪氨酸和色氨酸在280nm处的吸收值可用于估算蛋白质、缓冲离子、核酸、乙醇等的含量，其中对计数影响最为严重。

SDS-PAGE电泳注意事项：

1、浓缩胶的目的是使上样的样品以同一水平面进入分离胶。理论上，分离胶电泳如果长时间在低电压下进行，分离效果会更好。浓缩胶在分离胶为80V、分离胶为150V时运行效果较好。同时，制作凝胶前一定要搅拌均匀。分离双蒸水时一定要轻轻加入，避免稀释上层分离胶，使凝胶不均匀。

2. 所有蛋白样品的定量和体积相同，不足的蛋白样品用裂解缓冲液补充。在样品两侧泳道中加入等体积的1Loading Buffer，标记也用等体积的1Loading Buffer配制，避免顶部通道电泳时扩散，造成电泳错误。两个频道。

3、一般上样量为3。Western-Blot为30~100 g，结果与目的蛋白丰度、上样量、一抗和二抗量、孵育时间等因素有关。显色时间的长短。在探索条件时，为了得到一定的结果，可以每一步测试更多、时间更长。

印迹膜：的选择

密封剂选择：

脱脂奶粉：很受欢迎，经济且易于制备。脱脂奶粉是多种蛋白质的混合物，但如果你的蛋白质是磷蛋白，就不要选择脱脂奶粉，因为会有很多背景信号。

BSA: 牛血清白蛋白是从牛血清中纯化的球蛋白。然而，一些BSA制剂含有酪氨酸磷酸化蛋白，如果使用抗酪氨酸抗体，则会干扰检测。

市售的封闭剂：的优点是确保不含其他封闭剂中不可避免的磷蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、生物素等成分，而且价格相对较高。

发光液体选择：

不同的基材采用不同的显色方法。

显色基材（显色基材/显色体）

HRP（辣根过氧化物酶）:HRP底物显色是指底物（DAB-二氨基联苯胺等）。 ）在HRP和过氧化氢存在下失去电子，棕色不溶性沉淀物积聚在膜上；

AP（碱性磷酸盐）:AP底物的显色是基于使用底物（BCIP/NBT-5溴-4氯-3吲哚磷酸酯）在AP存在下生成蓝紫色沉淀产物并积累在膜；

化学发光底物（化学发光）

HRP: 在H2O2 存在下，HRP 氧化化学发光物质鲁米诺，生成激发态的邻苯二胺。当激发态复合物回到基态时，它发出428nm的蓝光。

AP: 二氧戊环磷酸盐是AP 的化学发光底物；

选择灵敏度更高的HRP 底物并获得更好的数据将带来三重好处： 更好、更快、更便宜。

蛋白质印迹转移技术：

胶片转印的方法有很多种，常见的有干式转印和湿式转印。

但换乘时间很长，且一次性换乘次数有限，少则4小时，多则2小时。现在有一种神奇的装置，可以通过Western Blot快速高效地完成蛋白质转移。

那么如何解决这个问题：

天能VE-586

同时转移四块凝胶

节省一半时间。

效率大幅提升

最重要的是安全。

运行特点

可同时转印4块99cm凝胶。换乘时间为15-60分钟。罐体高强度，消除液体泄漏的烦恼。专用开放式转胶架，操作方便。多重安全设计，解决操作安全问题。

接下来我们看一下实验中的一些小问题以及对应的解决方案：

解决了这些问题之后，何必担心自己的WB实验不完美呢？解决科研问题，分分钟获得实验数据！

昆明纳瑞科技有限公司

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